組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量檢測試劑盒產品說明書 主要用途 組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DPPH）定量檢測試劑是一種旨在通過有機氮自由基染料DPPH的參與，在抗氧化劑的存在下，通過分光光度儀，觀察其峰值下降的變化，來定量檢測對應于標準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即消除自由基等值濃度的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種新鮮組織（動物、人體、植物、昆蟲等）的總抗氧化能力檢測。可以被用于細胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定。 技術背景 超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypocorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如冠心病、風濕性關節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統(tǒng)內，通過抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性和尿酸（bilirubin）等，產生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過穩(wěn)定的有機氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化劑的去自由基作用，呈現深紫色轉化為黃色的變化，衡量體系中抗氧化劑捕獲自由基、消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（515nm波長）的幫助下，觀察其峰值下降的變化，并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。 產品內容 清理液（Reagent A） 250毫升 低滲液（Reagent B） 25毫升 緩沖液（Reagent C） 20毫升 染色液A（Reagent D1） 1瓶 染色液B（Reagent D2） 10毫升 標準液（Reagent E） 200微升 產品說明書 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，有效保證6月 用戶自備 15毫升錐形離心管：用于組織樣品操作的容器 2毫升離心管：用于組織樣品操作的容器 1.5毫升離心管：用于組織裂解懸液存放的容器 4℃微型臺式離心機：用于樣品操作 超聲儀：用于破碎組織細胞 200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器 分光光度儀或酶標儀：用于比色分析 實驗步驟 一、 樣品準備 1． 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量200毫克 2． 移入到一個液氮凍存管 3． 即刻放進液氮罐過夜 4． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融） 5． 放進一個15毫升錐形離心管 6． 加入2毫升4℃預冷的 清理液（Reagent A） 7． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻 8． 轉移到4℃預冷的2毫升離心管 9． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 10． 小心抽去上清液 11． 加入1毫升4℃預冷的 清理液（Reagent A），混勻 12． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415） 13． 小心抽去上清液 14． 重復實驗步驟11至13二次 15． 加入500微升低滲液（Reagent B），混勻 16． 置于200瓦超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里 17． 超聲功率為100％，猝擊10秒，2個循環(huán) 18． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415） 19． 移取上清液到新的4℃預冷的1.5毫升離心管 20． 移取10微升進行蛋白定量檢測（建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1） 21． 使用清理液（Reagent A）調整蛋白濃度為100微克/10微升 22． 置于冰槽里待測 二、標準液準備 1． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管 2． 分別加入50微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管 3． 移取100微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻 4． 小心移取50微升1號管的標準液（Reagent E）到2號管，混勻 5． 小心移取50微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻 6． 小心移取50微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻 7． 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表 管號 | 緩沖液（Reagent C） | 標準液（Reagent E） | 測定體系 標準 Trolox濃度 | 1 | 0 | 100微升 | 80微摩爾/升 | 2 | 50微升 | 50微升 | 40微摩爾/升 | 3 | 50微升 | 50微升 | 20微摩爾/升 | 4 | 50微升 | 50微升 | 10微摩爾/升 | 5 | 50微升 | 0 | 0 |
三、 樣品測讀 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化，移取5毫升染色液B（Reagent D2）到1瓶染色液A（Reagent D1）里，混勻，置于暗室里，標記為染色工作液，避免光照。然后進行下列操作。 1． 準備1個96孔板，做好標記：空白對照孔、標準樣品孔、待測樣品孔 2． 分別移取205微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里的每個孔里 3． 分別加入25微升染色工作液 4． 加入20微升緩沖液（Reagent C）到空白對照孔 5． 加入20微升上述配制的標準液（Reagent E）到相應標準樣品孔里 6． 加入20微升樣品（100微克蛋白總量）到待測樣品孔里 7． 輕輕搖動96孔板，使其混勻 8． 室溫下孵育15分鐘 9． 即刻放進酶標儀里測讀：515nm波長 10． 分析結果： 1） 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（OD515nm）；橫座標（X軸）為標準Trolox濃度（微摩爾/升） 2） 空白對照孔為最大吸光單位（OD515nm）讀數 3） 標準樣品孔和待測樣品孔為實際吸光單位（OD515nm）讀數 4） 根據標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升） 5） 計算樣品實際總抗氧化能力 【根據標準曲線獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）×0.25（體系容量：毫升）×樣品稀釋倍數】÷0.02（樣品容量：毫升）=（微摩爾/升TROLOX等值） 6） 根據下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實際抑制百分率） 【（空白對照孔吸光單位讀數－實際吸光單位讀書）÷空白對照孔吸光單位讀數】×100％ 7） IC50:50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品蛋白量（毫克/毫升）或樣品容量（微升） X（所需樣品單位）=（已知樣品單位÷實際抑制百分率）×50％ 注意事項 1． 本產品為50次操作，包括標準品 2． 本產品測試范圍為10至100微摩爾Trolox等值 3． 操作時，須戴手套 4． 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態(tài)下進行 5． 用戶可以調整標準曲線區(qū)間 6． 測試前，樣品須新鮮收集 7． 樣品須清澈 8． 空白對照孔的吸光讀數應為1.0左右為佳 9． 樣品讀數越低，抗氧化能力越高 10． 可以使用比色皿檢測 11． 如果樣品抗氧化劑濃度過高或過低， 建議稀釋或增加樣品容量或濃度 12． 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1） 13． 如果測試樣品很多，建議使用排槍移液 14． 本公司提供系列抗氧化分析試劑產品 質量標準 1． 本產品經鑒定性能穩(wěn)定 2． 本產品經鑒定檢測敏感
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