主要用途 細(xì)菌糖類總量硫酸-比色法定量檢測試劑是一種旨在通過硫酸處理后，水解產(chǎn)生單糖，與反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物，即采用比色法測算糖類總量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞樣品中糖類總量的檢測。產(chǎn)品即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。 技術(shù)背景 糖類（saccharide），又稱為碳水化合物（carbohydrate），其分成四類：單糖（monosaccharide；例如葡萄糖）、二糖（disaccharide；例如蔗糖）、寡糖（oligosaccharide；棉籽糖）和多糖（polysaccharide；例如淀粉和糖原）。糖類構(gòu)成輔酶和核酸，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要元素，在能量儲存、免疫功能、授精、預(yù)防病理變化、血液凝結(jié)、發(fā)育等方面具有重要作用。使用濃硫酸，將復(fù)雜性多糖水解成單糖，脫水產(chǎn)生反應(yīng)性中間產(chǎn)物，與反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物，在分光光度儀（492nm 波長）下出現(xiàn)吸光峰值的變化，來定量測定樣品中糖類量的總含量。 產(chǎn)品內(nèi)容 稀釋液（Reagent A） 5毫升 反應(yīng)液（Reagent B） 5毫升 酸性液（Reagent C） 25毫升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D） 500微升 裂解液（Reagent E） 10毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和反應(yīng)的容器 干式恒溫儀或恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育 超聲儀：用于裂解細(xì)菌細(xì)胞 比色皿：用于比色的容器 分光光度儀：用于比色分析 實(shí)驗(yàn)步驟 一、樣品準(zhǔn)備 1．準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM 2．直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107細(xì)胞/毫升 3．置于冰槽里5分鐘 4．放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g 5．小心抽去上清液 6．加入500微升裂解液（Reagent E），充分混勻 7．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管 8．強(qiáng)力渦旋震蕩15秒 9．置于超聲儀下：200瓦，50%功率，10秒一次，重復(fù)3次 10．冰槽里靜置15分鐘 11．放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 12．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管 13．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1） 14．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制 1．準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管 2．分別加入200微升稀釋液（Reagent A）到每個(gè)離心管 3．移取200微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號管，混勻 4．小心移取200微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號管，混勻 5．小心移取200微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號管，混勻 6．小心移取200微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號管，混勻 7．將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表 | 管號 | 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D） | 稀釋液（Reagent A） | 測定體系中標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖含量 | | 1 | 200微升 | 200微升 | 50微克 | | 2 | 200微升1號管 | 200微升 | 25微克 | | 3 | 200微升2號管 | 200微升 | 12.5微克 | | 4 | 200微升3號管 | 200微升 | 6.125微克 | | 5 | —— | 200微升 | 0 | 三、樣品測定 1．設(shè)定好分光光度儀：波長492nm，并置零 2．分別移取200微升反應(yīng)液（Reagent B）到1.5毫升離心管 3．分別加入200微升上述制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測樣品，混勻 4．分別加入1毫升酸性液（Reagent C），混勻 5．在80℃干式恒溫儀孵育30分鐘（注意：如果復(fù)雜多糖無法充分水解，建議使用煮沸5至30分鐘處理） 6．室溫下冷卻10分鐘，避免光照 7．轉(zhuǎn)移到新的比色皿 8．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（492nm波長）：獲得吸光讀數(shù) 9．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖含量（微克） 10．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖含量（微克） 11．計(jì)算樣品實(shí)際麥芽糖濃度（微克/毫升） 【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖含量（微克）÷0.2（樣品容量：毫升）】×10（樣品稀釋倍數(shù)）=微克/毫升 注意事項(xiàng) 1．本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液 2．本產(chǎn)品適用于還原性、非還原性糖類、寡糖以及復(fù)雜性糖類，但不適合于氨基糖或脫氧糖及其衍生物 3．本產(chǎn)品檢測范圍為0.2至50微克糖類總量 4．本產(chǎn)品適用于96孔板操作，實(shí)際用量按比例減少 5．操作時(shí)，須戴手套 6．酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全 7．孵育時(shí)，避免光照 8．如果待測樣品濃度過高或過低，可以稀釋樣品用量；注意在計(jì)算實(shí)際濃度時(shí)，不要忘記稀釋倍數(shù)調(diào)整 9．糖類總量表述方式：微克麥芽糖/毫升；微克麥芽糖/細(xì)胞量；微克麥芽糖/總蛋白量 10．本公司提供系列糖類檢測試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2.本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感 |
