HL10112.2 v.A 純化線粒體氧化應激活性氧魯米諾化學發(fā)光法定量檢測試劑盒產品說明書 主要用途 純化線粒體氧化應激活性氧（ROS）魯米諾化學發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過自由基探針魯米諾和強化劑的參與下，線粒體樣品中的活性氧族使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學發(fā)光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測樣品中活性氧族（過氧化氫）的生成和數量的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種生物體線粒體組分的活性氧族的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。 技術背景 超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風濕性關節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。線粒體是真核細胞的膜性細胞器，是產生活性氧、進行氧化還原反應的重要場所。魯米諾（luminol），又稱氨基鄰苯二甲酰肼（luminol；3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一種脂溶性的發(fā)光劑，氧化后生成魯米諾自由基而化學發(fā)光，具有460nm左右峰值的帶狀光譜，肉眼可觀察到鮮明的紫藍色。魯米諾以單價氧化形式與超氧自由基陰離子反應，產生不穩(wěn)定性內過氧化物或二氧環(huán)丁烷（Dioxetane），由此分解成電激發(fā)狀態(tài)，通過釋放光子，回復到基態(tài)。魯米諾作為探針，可以檢測線粒體中過氧化氫、超氧自由基陰離子和羥自由基，其中過氧化氫zui強，其發(fā)光強度與過氧化氫水平成正相關。 產品內容 清理液（Reagent A） 毫升 強化液（Reagent B） 毫升 發(fā)光液（Reagent C） 毫升 產品說明書 1份 保存方式 保存強化液（Reagent B）和發(fā)光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器 恒溫水槽：用于樣品孵育 微型臺式離心機：用于去除樣品雜質 測試管或黑色96孔板：用于發(fā)光檢測用的容器 化學發(fā)光儀：用于檢測化學發(fā)光 實驗步驟 - 移取100微升新鮮制備（2小時內）的純化線粒體（400微克線粒體蛋白）到預冷的1.5毫升離心管，置于冰槽里
- 加入xx微升清理液（Reagent A），輕輕混勻線粒體
- 放進37℃恒溫水槽孵育10分鐘
- 加入10微升用戶自備的待測藥品
- 即刻進入下列測讀操作
測讀開始前，打開化學發(fā)光儀，設定儀器內溫度為37℃預熱和整合測讀10秒或 15分鐘；然后關掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。 - 準備好測試管，做好標記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
- 移取xx微升清理液（Reagent A）到陰性對照測試管
- 移取400微升上述預處理的待測線粒體到樣品本底測試管
- 移取400微升上述預處理的待測線粒體到樣品活性測試管
- 分別加入xx微升強化液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管外
- 分別加入xx微升發(fā)光液（Reagent C）到上述測試管，除樣品本底測試管外
- 輕輕渦旋混勻
- 即刻放進37℃化學發(fā)光儀里測讀
- 整合測讀10秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；RLU）
- 或者整合測讀15分鐘，獲得光電子讀數：X 106 CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）
- 計算ROS水平：
注意事項 - 本產品為50次操作
- 操作時，須戴手套
- 測試前，線粒體分離后2小時內為
- 線粒體懸液須在4℃溫度下保存?zhèn)溆?/span>
- 如果測定體系變化，則試劑用量相應變化
- 系統(tǒng)操作過程中，陰性對照只需測定一次
- 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
- 如果是注射式化學發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學發(fā)光儀注射（injector）管道
- 本公司提供系列活性氧分析試劑產品
質量標準 - 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
- 本產品經鑒定檢測敏感
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