細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑盒 產(chǎn)品說明書（中文版） 主要用途 細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子，由PicoGreen特異染色，即采用熒光法來測定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，以及抑制劑檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE；EC2.7.7.49），又稱為RNA依賴性DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），是將單鏈RNA分子轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA的DNA聚合酶，包括HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus；MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus；AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（omerase reverse transcriptase） 等。逆轉(zhuǎn)錄病毒使用逆轉(zhuǎn)錄酶達(dá)到逆轉(zhuǎn)錄RNA為DNA，然后整合到宿主基因組再復(fù)制。在真核生物中，端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶在分子生物學(xué)中得到廣泛運用。檢測逆轉(zhuǎn)錄酶活性成為病毒感染的監(jiān)測手段，同時作為藥物篩選的靶標(biāo)。基于由poly-A模板與oligo-dT引物構(gòu)成的雙鏈分子底物，在dTTP的參與下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子（heteroduplexes），由PicoGreen特異染色，根據(jù)熒光強(qiáng)度分析（激發(fā)波長480nm，散發(fā)波長520nm），來定量測定逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） | 毫升 | 裂解液（Reagent B） | 毫升 | 緩沖液（Reagent C） | 毫升 | 底物液（Reagent D） | 微升 | 終止液（Reagent E） | 微升 | 染色液（Reagent F） | 微升 | 稀釋液（Reagent G） | 毫升 | 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） | 微升 | 產(chǎn)品說明書 | 1份 |
保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器 細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離 DOUNCE勻漿器：用于裂解組織 臺式離心機(jī)：用于樣品操作 比色皿或酶標(biāo)板：用于熒光分析的容器 熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析 實驗步驟 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。 - 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 106細(xì)胞）
- 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
- 小心抽去清理液
- 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
- 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
- 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
- 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
- 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
- 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
- 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
- 即刻放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
- 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測
- 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
- 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm
- 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
- 分別加入xx微升裂解液（Reagent B）到1至5號管
- 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號管，混勻
- 小心移取xx微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號管，混勻
- 小心移取xx微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號管，混勻
- 小心移取xx微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號管，混勻
- 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
管號 | 裂解液（Reagent B） | 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） | 測定體系標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度 | 1 | xx微升 | xx微升 | xx納克/毫升 | 2 | xx微升 | xx微升1號管 | xx納克/毫升 | 3 | xx微升 | xx微升2號管 | xx納克/毫升 | 4 | xx微升 | xx微升3號管 | xx納克/毫升 | 5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作 - 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品
- 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的對應(yīng)孔里
- 分別加入xx微升底物液（Reagent D）
- 分別加入5微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
- 分別加入xx微升終止液（Reagent E）
- 分別加入xx微升染色工作液
- 室溫下孵育5分鐘，避免光照
- 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
- 實際熒光讀數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)樣品相對熒光讀數(shù)－5號管標(biāo)準(zhǔn)樣品相對熒光讀數(shù)（作為背景空對照）
- 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為實際熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度（納克/毫升）
四、樣品測定 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent F）置入冰槽里融化，然后移出2.5微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent G），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液（注意：5次操作量），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作 - 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
- 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的對應(yīng)孔里
- 加入xx微升底物液（Reagent D）
- 加入5微升待測樣品（注意：10微克純化酶蛋白或50微克裂解懸液蛋白）
- 室溫下孵育60分鐘
- 分別加入xx微升終止液（Reagent E）
- 分別加入xx微升染色工作液
- 室溫下孵育5分鐘，避免光照
- 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
- 實際熒光讀數(shù)：待測樣品相對熒光讀數(shù)－5號管標(biāo)準(zhǔn)樣品相對熒光讀數(shù)（作為背景空對照）
- 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)DNA濃度（納克/毫升）
- 實際活性計算：
注意事項 - 本產(chǎn)品為20次操作
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定只需1次
- 樣品須澄清，至關(guān)重要
- 樣品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等
- 反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定
- 測定值由低到高變化
- 樣本測定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
- 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為10微克/5微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為50微克/5微升
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
- 逆轉(zhuǎn)錄酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.1條件下，每小時內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄1納克DNA所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列逆轉(zhuǎn)錄酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) - 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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