組織硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）比色法定量檢測(cè)試劑盒 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版） 主要用途 組織硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)TBARS（硫代巴比妥酸反應(yīng)物）技術(shù)，檢測(cè)與之反應(yīng)的丙二醛，其產(chǎn)物丙二醛雙硫代巴比妥酸加合物，在分光光度儀下，檢測(cè)其吸光峰值的變化，即采用比色法測(cè)定組織樣品中硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物組織（人體、動(dòng)物、昆蟲(chóng)等）中硫代巴比妥酸反應(yīng)物的含量檢測(cè)。廣泛用于組織氧化應(yīng)急研究，特別是脂質(zhì)過(guò)氧化的分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。 技術(shù)背景 脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)（lipid peroxidation；LPO）是動(dòng)物和植物細(xì)胞損傷的一種機(jī)制，也是評(píng)價(jià)細(xì)胞和組織氧化應(yīng)急的標(biāo)志。含有兩個(gè)或以上雙鍵（double bond）的多聚不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid）對(duì)自由基以及其它活性氧化族高度敏感，導(dǎo)致產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧自由基LOO＋（lipid peroxyl radical），使脂類氧化（lipid oxidation）。脂質(zhì)過(guò)氧化自由基LOO＋同時(shí)通過(guò)攻擊分子內(nèi)雙鍵，經(jīng)環(huán)化、裂解形成環(huán)狀內(nèi)過(guò)氧化物（cyclic endoperoxide），例如丙二醛（malondialdehyde；MDA）和4-羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal；HNE）等氫過(guò)氧化物（hydroperoxide）和醛（aldehyde），為自然產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，屬于硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）混合物。硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量增加，表明氧化應(yīng)急增強(qiáng)。作為脂質(zhì)過(guò)氧化性低分子量終端產(chǎn)物之一的丙二醛，廣泛用于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的指標(biāo)，即硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance；TBARS）表述為丙二醛等類物（MDA equivalentlent），以評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化或氧化應(yīng)急程度。在丁羥甲苯（Butylated Hydroxytoluene；BHT）和EDTA的參與幫助減少干擾性脂類氧化的情況下，丙二醛與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid；TBA）進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛雙硫代巴比妥酸加合物（MDA-TBA2），通過(guò)分光光度儀（532nm波長(zhǎng)）來(lái)定量分析硫代巴比妥酸反應(yīng)物的含量，其反應(yīng)方式為： 產(chǎn)品內(nèi)容 緩沖液（Reagent A） | 毫升 | 裂解液（Reagent B） | 毫升 | 抗干擾液（Reagent C） | 微升 | 萃取液（Reagent D） | 毫升 | 反應(yīng)液（Reagent E） | 管 | 補(bǔ)充液（Reagent F） | 毫升 | 稀釋液（Reagent G） | 毫升 | 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) | 1份 |
保存方式 保存在4℃冰箱里，抗干擾液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent E）避免光照，并密封；萃取液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月 用戶自備 15毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器 1.5毫升離心管：用于制備樣品和樣品反應(yīng)的容器 超聲儀：用于裂解組織的儀器 （微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集、澄清 恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育 酶標(biāo)板：用于比色的容器 酶標(biāo)儀：用于樣品比色分析 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent E） 置入冰槽里。移取xx微升稀釋液（Reagent G）到 反應(yīng)液（Reagent E）管里，渦旋混勻，標(biāo)記為反應(yīng)工作液（10次操作量）。同時(shí)設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)532nm。然后進(jìn)行下列操作。 一、樣品準(zhǔn)備 - 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管（500毫克組織）
- （選擇步驟）加入xx毫升緩沖液（Reagent A）
- （選擇步驟）小心抽去緩沖液（Reagent A）
- 移入到一個(gè)液氮凍存管
- 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
- 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
- 強(qiáng)力渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊5秒
- 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
- 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
- （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，并調(diào)整蛋白濃度為20至50毫克/毫升
- 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、比色測(cè)定 - 準(zhǔn)備10個(gè)1.5毫升離心管，并做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
- 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）
- 分別加入xx微升抗干擾液（Reagent C）
- 分別加入xx微升補(bǔ)充液（Reagent F）或待測(cè)樣品（注意：總量為1至2毫克總蛋白）
- 用槍頭混勻
- 分別加入xx微升萃取液（Reagent D）
- 用槍頭混勻
- 分別加入xx微升反應(yīng)工作液
- 蓋上蓋子，上下傾倒數(shù)次，混勻
- 放進(jìn)60℃恒溫水槽，孵育60分鐘
- 放進(jìn)冰槽里冷卻2分鐘
- 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為10000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 分別移取250微升上清液到96孔酶標(biāo)板的相應(yīng)孔里（注意：上清須澄清）
- 放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)
- 樣品實(shí)際讀數(shù)：（樣品讀數(shù)－背景對(duì)照讀數(shù)）
三、計(jì)算樣品總濃度 注意事項(xiàng) - 本產(chǎn)品為20次操作
- 操作時(shí)，須戴手套
- 用戶可以采用組織勻漿（30秒）處理代替超聲處理
- 萃取液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
- 反應(yīng)液（Reagent E）為固體，避免在室溫下放置；配制后，有效期1周
- 抗干擾液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent E）避免光照，并密封
- 本產(chǎn)品檢測(cè)敏感度可達(dá)0.05微摩爾丙二醛等類物
- 50微摩爾的過(guò)氧化氫和0.25摩爾蔗糖會(huì)干擾檢測(cè)（使丙二醛減少13％）
- 如果樣品含有過(guò)高的蛋白成分，建議進(jìn)行樣品去蛋白處理
- 可以使用煮沸10分鐘替代60℃孵育反應(yīng) 60分鐘
- 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
- 正常樣品的硫代巴比妥酸反應(yīng)物濃度相當(dāng)?shù)停s在皮摩爾水平，即10至100皮摩爾/毫克蛋白
- 本公司提供系列丙二醛檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) - 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
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