植物磷脂酶Dα活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒 產(chǎn)品說明書 主要用途 植物磷脂酶Dα（Phospholipase Dα）活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑是一種旨在通過磷脂酶Dα、膽堿激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法來測定植物組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等裂解萃取樣品中磷脂酶Dα的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 磷脂酶（phospholipase），是一種脂質(zhì)水解酶，催化磷脂的水解，產(chǎn)生脂肪酸和其它親脂產(chǎn)物，參與磷脂代謝。磷脂酶家屬有四種類型亞酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙?；?；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同時水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙?；?，又稱為溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipase C；PLC）在磷酸基前水解，釋放二酰基甘油（diacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipase D；PLD；EC3.1.4.4）在磷酸基后水解，釋放磷脂酸（phosphatidic acid）。植物磷脂酶D，屬于異源性酶（heterogeneous enzyme）家屬成員，與哺乳動物磷脂酶D不同，有4個異構(gòu)體：α、β、γ和δ：PLDα是磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate；PIP2）-非依賴性的常見的植物PLD酶，而PLDβ和PLDγ是磷酸磷脂酰肌醇輔因子（polyphosphoinositide cofactor）依賴性；PLDγ在氨基酸序列同源性和生化特性上類似于PLDβ；PLDδ為膜相關(guān)性，游離油酸（oleic acid）可以激活。PLDα通過催化特異性磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine；PC）上磷酸二酯鍵（phosphodiester）的水解，產(chǎn)生磷脂酸和膽堿（choline），磷脂酸作為信號分子，進一步水解為二?；视停c跨膜信號功能、亞細胞結(jié)構(gòu)質(zhì)膜的降解和重構(gòu)等有關(guān)。同時通過轉(zhuǎn)移磷脂基團到原生醇類的羥基上的磷脂轉(zhuǎn)移活性（transphosphatidylation）。PLDα異常將導(dǎo)致細胞膜損害、細胞功能缺失、衰老等密切相關(guān)。基于底物磷脂酰膽堿，在磷脂酶Dα的作用下，水解產(chǎn)生為磷脂酸和膽堿后，通過膽堿激酶（choline kinase）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）系統(tǒng)，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的峰值變化（340nm 波長），來定量分析磷脂酶Dα的活性。磷脂酶Dα連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為： PLDα phosphatidylcholine + H2O → phosphatidic acid + choline choline kinase choline + ATP → o-phosphocholine + ADP pyruvate kinase ADP + phosphoenolpyruvate → ATP + pyruvate lactate dehydrogenase pyruvate + NADH → lactate + NAD＋ （高吸收峰） （低吸收峰） 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） 60毫升 裂解液（Reagent B） 20毫升 緩沖液（Reagent C） 5毫升 反應(yīng)液（Reagent D） 500微升 酶促液（Reagent E） 500微升 底色液（Reagent F） 500微升 陰性液（Reagent G） 500微升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存－20℃冰箱里；底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于樣品保存和反應(yīng)操作的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器 DOUNCE勻漿器：用于組織勻化 （微型）臺式離心機：用于樣品操作 比色皿或96孔板：用于比色的容器 分光光度儀或酶標儀：用于比色分析 實驗步驟 - 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量
- （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 即刻用刀片切碎組織
- 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
- 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
- 即刻移入到1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）
- 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 開啟并設(shè)定好分光光度儀或酶標儀（溫度為30℃）：波長340nm，并置零
- 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent F）避免光照
- 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
- 移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
- 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入10微升陰性液（Reagent G）
- 渦旋震蕩5秒
- 在30℃溫度下孵育10分鐘，期間渦旋震蕩3次，每次5秒
- 煮沸5分鐘
- 室溫下靜置15分鐘冷卻
- 轉(zhuǎn)移到250微升比色皿或96孔板
- 加入25微升酶促液（Reagent E）
- 加入20微升底色液（Reagent F）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為0分鐘讀數(shù)
- 取出比色皿
- 室溫下孵育20分鐘
- 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為20分鐘讀數(shù)
- 背景空對照讀數(shù)＝0分鐘讀數(shù)－20分鐘讀數(shù)
- 移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
- 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入10微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
- 渦旋震蕩5秒
- 在30℃溫度下孵育10分鐘，期間渦旋震蕩3次，每次5秒
- 煮沸5分鐘
- 室溫下靜置15分鐘冷卻
- 轉(zhuǎn)移到250微升比色皿或96孔板
- 加入25微升酶促液（Reagent E）
- 加入20微升底色液（Reagent F）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為0分鐘讀數(shù)
- 取出比色皿
- 室溫下孵育20分鐘
- 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為20分鐘讀數(shù)
- 樣品總活性讀數(shù)＝0分鐘讀數(shù)－20分鐘讀數(shù)
比色皿計算 [（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 單位＝微摩爾PC/分鐘 96孔板計算 [（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6 （光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 單位＝微摩爾PC/分鐘 注意事項 - 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
- 樣品須澄清，至關(guān)重要
- 測定值由高到低變化
- 比色測定后，比色皿須清洗*
- 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于20分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
- 用戶可以使用磷脂酶Dα抑制劑N-月桂酰乙醇胺（N-lauroylethanolamine；12:0；IC50=150納摩爾）作為陰性對照或抑制劑陽性對照
- 磷脂酶Dα單位活性定義為：在30℃，pH 6.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解1微摩爾磷脂酰膽堿所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列磷脂酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準 - 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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