乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說明書
微量法
產(chǎn)品內容：
提取液：60mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑一：液體5 mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入1.3 mL 雙蒸水充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用；
試劑三：液體5 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：液體20 mL×1 瓶，4℃保存；
產(chǎn)品簡介：
LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化
丙酮酸與乳酸之間的可逆反應，伴隨著NAD+/NADH 之間互變。
LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯
腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
試驗中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣品測定的準備：
1. 細菌或培養(yǎng)細胞：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：
提取液體積（mL）為500-1000:1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提取液），超聲波破碎
細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30 次），8000g 4℃離心10min，
取上清，置冰上待測。
2. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1:5-10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL
提取液），進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3. 血清（漿）樣品：直接檢測。
HL-W-A001
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二、測定操作：
1. 分光光度計預熱30min 以上，調節(jié)波長至450nm，蒸餾水調零。
2. 樣本測定（在EP 管中加入下列試劑）
試劑名稱(μL) 測定管對照管
樣本10 10
試劑一50 50
試劑二10
蒸餾水10
充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴15min
試劑三50 50
充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴15min
試劑四150 150
充分混勻，室溫靜置3min，450 nm 下測定吸光度，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需要
設一個對照管。
LDH 活力單位計算：
A、用微量石英比色皿測定的計算公式如下：
1. 標準條件下測定的回歸曲線，y = 0.725x (x 為標準品濃度，μmol/mL；y 為對吸光度)。
2. 血清（漿）LDH 活力的計算
單位的定義：每mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/mL）=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA
3. 細胞、細菌和組織中LDH 活力的計算
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (V1×Cpr) ÷T×103 =92×ΔA÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質含量測定試劑盒。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/g 鮮重）=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (W ×V1÷V2) ÷T×103 =92×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/104 cell）= [ΔA÷0.725×V 1]÷(500 ×V1÷V2) ÷T×103 =0.184×ΔA÷W
V1：加入反應體系中樣本的體積，0.01 mL；V2：加入提取液的體積，1 mL； T：反應時間，15 min；
Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g; 500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。103：1μmol/mL=103nmol/mL。
B、用96 孔板測定的計算公式如下：
1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.3625x (x 為標準品濃度，μmol/mL；y 為對吸光度)。
2、血清（漿）LDH 活力的計算
單位的定義：每mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/mL）=ΔA÷0.3625÷T×103=184×ΔA
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2、細胞、細菌和組織中LDH 活力的計算
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.3625×V 1] ÷ (V1×Cpr) ÷T×103 =184×ΔA÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質含量測定試劑盒。
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/g 鮮重）=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (W ×V1÷V2) ÷T×103 =184×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH（U/104 cell）= [ΔA÷0.3625×V 1]÷(500 ×V1÷V2) ÷T×103 =0.368×ΔA÷W
V1：加入反應體系中樣本的體積，0.01 mL；V2：加入提取液的體積，1 mL；T：反應時間，15min；
Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g; 500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。103：1μmol/mL=103nmol/mL。
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