主要用途 動物細胞高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑是一種旨在通過機械或化學處理、差速和等密度離心方法，從動物細胞中分離出活性完整而高度純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞器組分的較好而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達99％。適合于各種動物原代和培養(yǎng)細胞（人體、老鼠、兔子等）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的制備?？梢员挥糜诩毎?/span>P450系統(tǒng)外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白和腔內(nèi)蛋白等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。 技術(shù)背景 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細胞器組分，構(gòu)成細胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，負責蛋白轉(zhuǎn)譯、折疊和轉(zhuǎn)運成為細胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負責鈣離子區(qū)隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產(chǎn)和儲存等功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分成三種：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據(jù)細胞代謝的需要，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會互相轉(zhuǎn)換。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過核糖體合成蛋白質(zhì)并分類；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質(zhì)網(wǎng)的主要功能為儲存和釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的常用手段之一：第一，通過機械或化學方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液（Reagent A） 100毫升 裂解液（Reagent B） 100毫升 凈化液（Reagent C） 10毫升 活性液（Reagent D） 100微升 強化液（Reagent E） 5毫升 保存液（Reagent F） 50毫升 高純液（Reagent G） 25毫升 分層液（Reagent H） 25毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 用戶自備 HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細胞 YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離 *細胞培養(yǎng)液（12052）：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基 50毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器 1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器 6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器 4℃臺式離心機：用于樣品制備 4℃超速離心機：用于樣品制備 DOUNCE勻漿器：用于裂解組織 試管固定支架：用于離心管固定支撐 3號針筒和18號針頭：用于收集樣品 實驗步驟 一、 組織勻漿法 實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、 1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。 1． 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面 2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去 3． 重復實驗步驟2一次 4． 加入3毫升用戶自備的YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面 5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種 6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落， 7． 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液 8． 移入一個50毫升錐形離心管 9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g 10． 小心抽去上清液 11． 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞 12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g 13． 小心抽去上清液 14． 加入5毫升預冷的裂解工作液 15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群 16． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器 17． 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7） 18． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管 19． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g 20． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解細胞 21． 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為12000g 22． 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF） 23． 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g 24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分 25． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物 26． 置于冰槽里備用 27． 準備1個6毫升超速離心管 28． 加入2.5毫升高純液（Reagent G） 29． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動） 30． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（注意：避免晃動） 31． 小心放進4℃超速離心機再次離心30分鐘，速度為130000g 32． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和下端三分之一處（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）棕色或乳黃色樣品帶 33． 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體 34． 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品 35． 進一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體 36． 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品 37． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F） 38． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為100000g 39． 小心抽去上清液 40． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻 41． 放進－70℃冰箱里保存 二、 化學處理法 實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。 1． 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面 2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去 3． 重復實驗步驟2一次 4． 加入3毫升用戶自備的YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面 5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種 6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落 7． 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液 8． 移入一個50毫升錐形離心管 9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g 10． 小心抽去上清液 11． 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A） 12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g 13． 小心抽去上清液 14． 加入5毫升預冷的裂解工作液 15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻 16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次 17． 加入500微升預冷的強化液（Reagent D） 18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻 19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8） 20． 加入5毫升預冷的裂解液（Reagent B），輕輕搖動試管混勻 21． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g 22． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解細胞 23． 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為12000g 24． 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF） 25． 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g 26． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分 27． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物 28． 置于冰槽里備用 29． 準備1個6毫升超速離心管 30． 加入2.5毫升高純液（Reagent G） 31． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動） 32． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（注意：避免晃動） 33． 小心放進4℃超速離心機再次離心30分鐘，速度為130000g 34． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和下端三分之一處（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）棕色或乳黃色樣品帶 35． 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體 36． 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品 37． 進一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體 38． 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品 39． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F） 40． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為100000g 41． 小心抽去上清液 42． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻 43． 放進－70℃冰箱里保存 注意事項 1． 本產(chǎn)品為10次（5 X 107動物細胞）操作 2． 操作時，須戴手套 3． 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent F） 4． 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進行 5． 建議使用足夠的樣品量 6． 建議嚴格控制操作時間 7． 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的組織細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù) 8． 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的組織細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù) 9． 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理 10． 腦組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉淀顆粒非常松動，注意操作損失 11． 通常5 X 107動物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量為500至1000微克蛋白 12． 本產(chǎn)品所獲得的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純度達95%以上 13． 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標志蛋白是NADPHXIBAOSESUC還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用 組織NADPHXIBAOSESUC還原酶活性比色法定量檢測試劑盒－50303.2 14． 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標志是核糖體RNA（ribosome RNA）；建議使用 RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑盒——20129 15． 本公司提供系列亞細胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標準 1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持正?；钚?/span> 3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶 |
