HL50607.2 v.A 組織γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉移法（FRET）定量檢測試劑盒產品說明書 主要用途 組織γ分泌酶（γ-SECRETASE）活性熒光共振能量轉移法（FRET）定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針NMA供體和DNP受體雙重標記的多肽底物，在γ分泌酶的水解作用下，釋放出強烈熒光的NMA，而發(fā)生熒光峰值的變化，即采用熒光共振能量轉移法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中γ分泌酶活性的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。 技術背景 γ分泌酶（γ-SECRETASE；EC3.4.24.81），是一種多亞體蛋白酶復合物（multisubunit protease complex），由4種蛋白組成：早老素蛋白（Presenilin；PS）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective 1；APH1）和早老素增強蛋白2（presenilin enhancer 2）。其為整合性跨膜蛋白，在早期內質網里組裝和成熟，后期內質網進行目標蛋白切離。γ分泌酶切離由β分泌酶切離淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein；APP）產生C99和α分泌酶切離的C83片段，前者成為具有神經毒性的40至42氨基酸長的淀粉樣β-多肽（amyloid-β peptide；Aβ）， 是阿茨罕默疾?。?/span>alzheimer disease；AD）的病理變化（淀粉樣斑；amyloid plaque）的主要成分，由此γ分泌酶成為阿茨罕默疾病治療的抗淀粉樣多肽藥物靶標。γ分泌酶與NOTCH調節(jié)有關。 基于底物多肽Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Val（源于淀粉樣淀粉樣β-多肽前體蛋白序列708-715），通過熒光共振能量轉移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體（acceptor），使得距離依賴性反應的供體的散發(fā)光子淬滅（quench），使用2個熒光探針N-甲基氨茴酰NMA（N-Methyl-anthraniloyl）供體和二硝基苯基DNP（2,4-Dinitrophenyl）受體作為FRET對，來標記的γ分泌酶選擇性多肽底物的兩端，在γ分泌酶的水解作用下，在丙氨酰（alaninyl）和蘇氨酰（threoninyl）殘基處切離，釋放出強烈熒光的NMA，在熒光分光光度儀下（激發(fā)波長340-360nm，散發(fā)波長440-450nm），來定量測定γ分泌酶的活性。其反應系統(tǒng)為： 產品內容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 緩沖液（Reagent C） 毫升 底物液（Reagent D） 微升 標準液（Reagent E） 微升 產品說明書 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）避免光照，有效保證6月 用戶自備 γ分泌酶：用于抑制劑篩選 1.5毫升離心管：用于標準樣品操作和樣品保存的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 （微型）臺式離心機：用于細胞預處理 黑色96孔板：用于熒光分析的容器 熒光酶標儀：用于熒光分析 實驗步驟 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。 一、樣品準備 1． 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管 3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次 4． 移入到一個液氮凍存管 5． 即刻放進液氮罐過夜 6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融） 7． 放進一個15毫升錐形離心管 8． 加入預冷的xx微升裂解液（Reagent B） 9． 轉移到預冷的1.5毫升離心管 10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻 11． 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>） 12． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 13． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管 14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1） 15． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 二、 測定準備 1． 準備好待測樣品（例如組織裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里 2． 設定好熒光酶標儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長355nm，散發(fā)波長440nm，增益倍數100至200，間隔10分鐘，讀數7次（共60分鐘） 3． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管 4． 加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1號管 5． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管 6． 移取xx微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻
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