HL10103.6 v.A 細菌琥珀酸脫氫酶（SDH）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書 主要用途 細菌琥珀酸脫氫酶（SDH）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成電子受體染料，通過反應系統(tǒng)測定染料還原后峰值的降低，即采用比色法測算樣品中單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細菌菌株裂解懸液和膜蛋白樣品琥珀酸脫氫酶的特異性活性檢測。用于衰老、能量代謝、蛋白組學、發(fā)酵分析等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。 技術(shù)背景 琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細胞線粒體膜相關(guān)的重要元素，位于線粒體內(nèi)膜，參與細胞呼吸鏈。細菌琥珀酸脫氫酶，又稱為SdhCDAB，為膜結(jié)合性蛋白，分為周邊（peripheral）和跨膜（transmembrane）部分，其中周邊親水部分由SdhA和SdhB亞體組成：SdhA亞體含有黃素蛋白（flavoprotein），是琥珀酸的活性部位；SdhB含有鐵硫蛋白（iron-sulfur protein），進行電子傳遞；跨膜疏水部分由SdhC和SdhD亞體組成：SdhC含有亞鐵血紅素-B（Heme-B），SdhD含有泛醌（ubiquinone）結(jié)合部位（Q部位）。其作用在于參與三羧酸循環(huán)（TCA cycle）和呼吸鏈活動。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸（succinate）的氧化反應，產(chǎn)生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子?；?/span>琥珀酸脫氫酶的反應原理，使用人工電子受體染料二氯靛酚鈉（2,6-Dichloroindophenol sodium；DCIP），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH2）的電子，而被還原，在分光光度儀下，其吸光值（600nm波長）的變化，來測算琥珀酸脫氫酶的活性。其反應方式為： 產(chǎn)品內(nèi)容 裂解液（Reagent A） 毫升 活性液（Reagent B） 微升 緩沖液（Reagent C） 毫升 反應液（Reagent D） 毫升 底物液（Reagent E） 毫升 陰性液（Reagent F） 微升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；反應液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸；底物液（Reagent E），避免光照；有效保證3月 用戶自備 15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器 超聲儀：用于裂解細菌細胞 （微型）臺式離心機：用于樣品操作 恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應物孵育 比色皿：用于比色測定的容器 分光光度儀：用于比色分析 實驗步驟 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent E）注意避光。然后進行下列操作。 一、樣品準備 - 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
- 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107細胞/毫升
- 置于冰槽里5分鐘
- 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
- 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
- 加入xx微升活性液（Reagent B）
- 強力渦旋震蕩15秒
- 至于超聲儀下超聲處理：100功率，20秒超聲一次，冰上間隙1分鐘，重復3次
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g
- 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
- 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準備 - 準備好待測樣品，置于冰槽里
- 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長600nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
- 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
- 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反應液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent E）
- 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入xx微升陰性液（Reagent F）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：OD0分鐘－OD5分鐘
- 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反應液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent E）
- 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入100微升待測樣品（注意：10微克總膜蛋白或100微克細菌總蛋白；樣品須溶解）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：OD0分鐘－OD5分鐘
注意事項 - 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照測定
- 操作時，須戴手套
- 反應液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸
- 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
- 加入樣品后3秒內(nèi)即刻比色測定
- 比色測定初始讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)）0.8左右為理想狀態(tài)
- 反應1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定持續(xù)5分鐘
- 測定值由高到低變化，即5分鐘測定讀數(shù)低于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
- 比色測定后，比色皿須清洗*
- 建議待測樣本周膜蛋白濃度為10微克/100微升和細菌總蛋白濃度為100微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供細菌可溶性膜蛋白制備試劑盒30022.2 和 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
- 活性計算時，可以選擇5分鐘內(nèi)單位時間zui大線性變化的吸光值
- 琥珀酸脫氫酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾氧化型二氯靛酚鈉（DCIP）所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列琥珀酸脫氫酶技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標準 - 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確
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