HL50259.4 v.A 細菌蘋果酸脫氫酶（MDH）活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書 主要用途 細菌蘋果酸脫氫酶（MDH）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過蘋果酸脫氫酶反應系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法來測定細菌裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌細胞裂解樣品例如紫色光能利用細菌（Purple phototropic）、嗜冷性細菌（psychrophilic）、嗜鹽性細菌（halophilic）等蘋果酸脫氫酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase；MDH；EC1.1.1.37），又稱為蘋果酸NAD氧化還原酶（L-Malate:NAD+ oxidoreductase），是檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle）中酶之一，為氧化還原酶，催化蘋果酸和草酰乙酸（oxaloacetate）的互相轉(zhuǎn)化反應，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）作為輔因子。同時參與非糖物質(zhì)小分子轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃钱惿╣luconeogenesis）作用。蘋果酸脫氫酶存在于所有真核細胞中，有2種同工酶：線粒體型（M型）和胞漿型（S型），由2個相同的亞體構(gòu)成，每個亞體分子量為35KD。細菌蘋果酸脫氫酶分成兩類：小分子量和大分子量。前者為60至65Kd分子量，同源二聚體，包括大腸桿菌（E. Coli）、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌，與真核生物，尤其是線粒體型類同；后者為117至146Kd分子量，同源四聚體，包括桿菌（Bacillus）、嗜熱細菌（Thermoactinomyces）、古細菌（Archaebacteria）等。碘化物，例如甲狀腺素（Thyroxine）、碘（iodine）、等抑制蘋果酸脫氫酶活性；而磷酸鹽、砷酸鹽（arsenate）和鋅離子可以激活蘋果酸脫氫酶。基于草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的催化下，逆轉(zhuǎn)化為蘋果酸，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光值的變化（340nm 波長），來定量測定蘋果酸脫氫酶的活性。蘋果酸脫氫酶反應系統(tǒng)為： 產(chǎn)品內(nèi)容 裂解液（Reagent A） 毫升 活性液（Reagent B） 微升 緩沖液（Reagent C） 毫升 反應液（Reagent D） 毫升 底色液（Reagent E） 毫升 陰性液（Reagent F） 微升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存活性液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器 超聲儀：用于裂解細菌細胞 （微型）臺式離心機：用于樣品制備 比色皿或96孔板：用于光度的容器 分光光度儀或酶標儀：用于光度分析 實驗步驟 - 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
- 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107細胞/毫升
- 置于冰槽里5分鐘
- 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
- 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
- 加入xx微升活性液（Reagent B）
- 強力渦旋震蕩15秒
- 置于超聲儀下超聲裂解處理：100瓦功率，20秒一次，間隔2分鐘，重復4次
- 放進4℃微型臺式離心機離心20分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
- 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
- 準備好待測樣品（例如細菌裂解樣品等），置于冰槽里
- 設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔30秒，讀數(shù)6次（共3分鐘），并置零
- 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
- 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反應液（Reagent D）
- 加入xx微升底色液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻
- 在25℃溫度下孵育5分鐘
- 加入xx微升陰性液（Reagent F）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－3分鐘讀數(shù)）
- 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反應液（Reagent D）
- 加入xx微升底色液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻
- 在25℃溫度下孵育5分鐘
- 加入20微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－3分鐘讀數(shù)）
六、酶標儀測定 - 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
- 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
- 分別加入xx微升反應液（Reagent D）
- 分別加入xx微升底色液（Reagent E）
- 輕輕搖動96孔板
- 在25℃溫度下孵育5分鐘
- 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
- 輕輕搖動96孔板
- 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘讀數(shù)和3分鐘讀數(shù)）
- 活性計算
注意事項 - 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
- 樣品須澄清，至關重要
- 加樣后3秒內(nèi)光度測定
- 反應1分鐘后光度測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定可持續(xù)3分鐘
- 光度測定后，比色皿須清洗*
- 背景空對照0分鐘讀數(shù)通常0.2至0.8為理想狀態(tài)
- 背景空對照的正常讀數(shù)差值（0分鐘－3分鐘）通常為0.001至0.005（正負即可）
- 樣品0分鐘讀數(shù)通常和背景空對照0分鐘讀數(shù)一致
- 樣本測定3分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
- 蘋果酸脫氫酶（MDH）單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾草酰乙酸和NADH至蘋果酸和NAD所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列蘋果酸脫氫酶學檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準 - 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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