組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶動力比色法定量檢測試劑盒 產(chǎn)品說明書 主要用途 組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性酶動力比色法定量檢測試劑是一種旨在通過特異反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)還原后峰值的增高,即采用比色法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品(動物、人體、植物、昆蟲、細(xì)菌等)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase;G6PD)是一種細(xì)胞漿中的酶,參與磷酸戊糖代謝通路,通過維持還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平,提供細(xì)胞還原性能量,進(jìn)而保持谷胱甘肽水平,幫助細(xì)胞,例如紅細(xì)胞,防止氧化損傷。同時NADPH的產(chǎn)生,促進(jìn)組織細(xì)胞(例如肝臟、脂肪組織、腎上腺等)生物合成脂肪酸、類異戊二烯等。在植物中,存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的多種異構(gòu)體,位于細(xì)胞漿、質(zhì)體基質(zhì)(plastidic stroma)、和過氧化體。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷將導(dǎo)致急性溶血性貧血,即蠶豆病?;谄咸烟?6-磷酸(D-glucose-6-phosphate)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下,轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂(6-phosphoglucono-δ-lactone) 產(chǎn)物后,同時其輔酶因子氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(xoidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADP)轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADPH),通過測定吸光值的變化(340nm 波長),來定量分析葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)為: 產(chǎn)品內(nèi)容 清理液(Reagent A) 毫升 裂解液(Reagent B) 毫升 緩沖液(Reagent C) 毫升 反應(yīng)液(Reagent D) 毫升 底色液(Reagent E) 毫升 陰性液(Reagent F) 毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存裂解液(Reagent B)、緩沖液(Reagent C)、反應(yīng)液(Reagent D)和底色液(Reagent E)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;反應(yīng)液(Reagent D)和底色液(Reagent E)避免光照;有效保證6月 用戶自備 1 1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器 15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器 (微型)臺式離心機:用于樣品操作 比色皿或酶標(biāo)板:用于比色的容器 分光光度儀或酶標(biāo)板:用于比色分析 實驗步驟 實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液(Reagent B)置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。 一、 樣品準(zhǔn)備 1. 手術(shù)取出動物組織,并秤重500毫克組織重量 2. (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管 3. (選擇步驟)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗 4. (選擇步驟)抽去清理液 5. 移入到一個液氮凍存管 6. 即刻放進(jìn)液氮罐過夜 7. 次日從液氮罐里取出,即刻(zui快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融) 8. 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管 9. 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B) 10.強力渦旋震蕩30秒,充分混勻 11.放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒(注意:如需暫時停止,放進(jìn)-70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫?br />12.即刻放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘,速度為10000g 13.小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管 14.移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-) 15.放進(jìn)-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用 二、 測定準(zhǔn)備 1. 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃):波長340nm,間隔60秒,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零 2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;底色液(Reagent E)避免光照 三、 背景對照測定 1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D) 3. 加入xx微升陰性液(Reagent F) 4. 上下傾倒數(shù)次,混勻 5. 在25℃溫度下孵育2分鐘 6. (選擇步驟)放進(jìn)分光光度儀,置零 2 7. (選擇步驟)取出比色皿 8. 加入xx微升底色液(Reagent E) 9. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi)) 10.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為背景空對照(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù)) 四、 樣品測定 1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿 2. 加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D) 3. 加入5微升待測樣品(20微克蛋白)(注意:樣品須清澈) 4. 上下傾倒數(shù)次,混勻 5. 在25℃溫度下孵育2分鐘 6. (選擇步驟)放進(jìn)分光光度儀,置零 7. (選擇步驟)取出比色皿 8. 加入xx微升底色液(Reagent E) 9. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi)) 10.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù)) 11.(選擇步驟)重復(fù)實驗步驟1至10,測讀新的樣品 五、計算樣品活性 [(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X (分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 單位=微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘 六、 酶標(biāo)板測定 1. 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對照和樣品 2. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C)到96孔板中 3. 分別加入xx微升反應(yīng)液(Reagent D) 4. 分別加入xx微升陰性液(Reagent F)或待測樣品(20微克蛋白)到相應(yīng)孔中(注意:樣品須清澈) 5. 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板 6. 在25℃溫度下孵育2分鐘 7. 分別加入xx微升底色液(Reagent E) 8. 輕輕搖動酶標(biāo)板 9. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測:5分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù) 10.活性計算 [(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X (分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 單位=微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘 3 注意事項 1. 本產(chǎn)品為50次操作,包括背景對照 2. 操作時,須戴手套 3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1次 4. 建議使用比色皿測定 5. 樣品須澄清,至關(guān)重要 6. 加樣后3秒內(nèi)比色測定 7. 測定值由低到高變化;測定可持續(xù)5分鐘 8. 比色測定后,比色皿須清洗* 9. 樣本測定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性 10.建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量(本公司提供 Bradford) 11.如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度 12.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶單位活性定義為:在25℃,pH 7.4條件下,每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾葡萄糖糖-6-磷酸至6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂所需的酶量作為一個活性單位 13.本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化經(jīng)典分析試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感 4 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 |