細(xì)胞NADH心肌黃酶活性染色試劑盒 產(chǎn)品說明書
主要用途
細(xì)胞NADH心肌黃酶活性染色試劑是一種旨在使用人工電子受體染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍(lán)（MTT），受到NADH心肌黃酶催化還原，產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑色色素沉淀，來細(xì)胞中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心改良傳統(tǒng)方法、成功實驗證明的。主要適用于各種動物細(xì)胞的心肌黃酶活性定性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。
技術(shù)背景
心肌黃酶（Diaphorase），又稱為硫辛酰胺脫氫酶（lipoamide dehydrogenase），黃遞酶，二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期從豬心肌中提取，產(chǎn)品又呈現(xiàn)熒光的黃綠色蛋白質(zhì)，故被稱為心肌黃酶。分子量102000至110000。NADH心肌黃酶直接和黃素蛋白（Flavoprotein）反應(yīng)，釋放出氫原子，將氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）還原為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），傳遞氫原子給氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作為電子供體，還原人工電子受體，例如染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍(lán)（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），產(chǎn)生不溶性甲暨色素，由此用于鑒別內(nèi)臟神經(jīng)細(xì)胞等各種動物細(xì)胞。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
固著液（Reagent B） 毫升
染色液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存染色液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
2毫升離心管：用于配制染色工作液
15毫升錐形離心管：用于配制染色工作液
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析
1
實驗步驟
操作一、25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶染色
染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取xx毫升染色液（Reagent C）到新的2毫升離心管，加入2xx微升 反應(yīng)液（Reagent D），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
1． 小心抽去25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗生長中的細(xì)胞表面
3． 小心抽去清理液
4． 小心加入xx毫升固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面
5． 在室溫下孵育5分鐘
6． 小心抽去固定液
7． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗細(xì)胞表面
8． 小心抽去清理液
9． 重復(fù)實驗步驟7和8二次
10．小心加入xx毫升染色工作液，覆蓋整個細(xì)胞表面
11．放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育5分鐘至60分鐘，或細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)黑色
12．小心抽去染色工作液
13．每孔加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗細(xì)胞表面
14．小心抽去清理液
15．重復(fù)實驗步驟13和14二次
16．即刻在光學(xué)顯微鏡下觀察和計數(shù)：表達(dá)NADH心肌黃酶的組織細(xì)胞為陽性組織細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)黑色。
操作二、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板染色
染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取xx毫升染色液（Reagent C）到新的15毫升錐形離心管，加入xx毫升反應(yīng)液（Reagent D），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
1. 小心抽去24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液
2. 每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗生長中的細(xì)胞表面
3. 小心抽去每孔里的清理液
4. 每孔加入xx微升固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面
5. 在室溫下孵育5分鐘
6. 小心抽去固定液
7. 每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗細(xì)胞表面
8. 小心抽去清理液
9. 重復(fù)實驗步驟7和8二次
10. 每孔加入xx微升染色工作液，覆蓋整個細(xì)胞表面
11. 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育5分鐘至60分鐘，或細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)黑色
12. 小心抽去染色工作液
13. 每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗細(xì)胞表面 2
14. 小心抽去清理液
15. 重復(fù)實驗步驟13和14二次
16. 即刻在光學(xué)顯微鏡下觀察和計數(shù)：表達(dá)NADH心肌黃酶的組織細(xì)胞為陽性組織細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)黑色
注意事項
1． 本產(chǎn)品為50次（2個24孔板）或10次（10個25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶）操作
2． 操作時，須戴手套
3． 反應(yīng)液（Reagent D）避免反復(fù)凍融
4． 陰性對照時，染色工作液不含有反應(yīng)液（Reagent D）
5． 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干
6． 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
7． 整個操作，在避光狀態(tài)下進(jìn)行
8． 染色孵育時間，根據(jù)樣品和酶活性強(qiáng)弱調(diào)整，通常為5至60分鐘
9． 染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察
10．樣品染色后保存，避免光照
11． 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：
操作容器
建議處理液規(guī)格
載玻片
100微升
載玻片培養(yǎng)皿
1毫升
35mm培養(yǎng)皿
1毫升
96孔培養(yǎng)板
100微升
48孔培養(yǎng)板
200微升
24孔培養(yǎng)板
500微升
12孔培養(yǎng)板
1毫升
6孔培養(yǎng)板
2毫升
25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶
3毫升
12．本公司提供NADH心肌黃酶活性NBT染色試劑產(chǎn)品
13．本公司提供系列組織細(xì)胞酶活性染色試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰 |
