細胞琥珀酸脫氫酶活性染色試劑盒 產品說明書 主要用途 細胞琥珀酸脫氫酶（SDH）活性染色試劑是一種旨在使用合成電子受體四氮唑蘭染料，通過反應系統(tǒng)的作用，組織樣本中酶活性部位呈現(xiàn)出藍黑色沉淀現(xiàn)象的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物和人體細胞樣品琥珀酸脫氫酶的活性檢測。用于衰老、能量代謝、蛋白組學、病理生理學、神經(jīng)病變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，顯色清晰。 技術背景 琥珀酸脫氫酶（succinnate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細胞線粒體膜相關的重要元素，位于線粒體內膜，參與細胞呼吸鏈。琥珀酸脫氫酶由27kd和70kd兩個單體組成。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反應，產生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子。基于琥珀酸脫氫酶的反應原理，使用人工電子受體染料硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH2）的電子，而被還原，產生不溶性藍色或藍黑色甲暨色素。據(jù)此證明組織細胞琥珀酸脫氫酶的活性。 產品內容 清理液（Reagent A） | 毫升 | 染色液（Reagent B） | 毫升 | 反應液（Reagent C） | 毫升 | 固著液（Reagent D） | 毫升 | 產品說明書 | 1份 |
保存方式 保存染色液（Reagent B）和反應液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器 培養(yǎng)箱：用于反應孵育 光學顯微鏡：用于細胞染色后觀察分析 實驗步驟 操作一、25cm2細胞培養(yǎng)瓶染色 染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取xx毫升染色液（Reagent B）到新的15毫升錐形離心管，加入xx微升反應液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。 - 小心抽去25cm2細胞培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液
- 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），鋪滿整個樣品表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 小心加入xx毫升染色工作液，鋪滿整個樣品表面
- 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
- 小心抽去染色工作液
- 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），鋪滿整個樣品表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 重復實驗步驟7至8二次
- 小心加入xx毫升固著液（Reagent D），鋪滿整個樣品表面
- 室溫下孵育15分鐘
- 小心抽去固著液（Reagent D）
- 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），鋪滿整個樣品表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 重復實驗步驟13至14二次
- 即刻在光學顯微鏡下觀察和計數(shù)：表達琥珀酸脫氫酶的組織細胞為陽性細胞，呈現(xiàn)藍黑色。
操作二、24孔細胞培養(yǎng)板染色 染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升反應液（Reagent C），混勻后，標記為染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。 - 小心抽去24孔細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液
- 小心加入xx微升清理液（Reagent A），鋪滿整個樣品表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 小心加入xx微升染色工作液，鋪滿整個樣品表面
- 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘，避免光照
- 小心抽去染色工作液
- 小心加入xx微升清理液（Reagent A），鋪滿整個樣品表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 重復實驗步驟7至8二次
- 小心加入xx微升固著液（Reagent D），鋪滿整個樣品表面
- 室溫下孵育15分鐘
- 小心抽去固著液（Reagent D）
- 小心加入xx微升清理液（Reagent A），鋪滿整個樣品表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 重復實驗步驟13至14二次
- 即刻在光學顯微鏡下觀察和計數(shù)：表達琥珀酸脫氫酶的組織細胞為陽性細胞，呈現(xiàn)藍黑色。
注意事項 - 本產品為50次（2個24孔板）或10次（10個25cm2細胞培養(yǎng)瓶）操作
- 操作時，須戴手套
- 反應液（Reagent C）避免反復凍融
- 陰性對照時，染色工作液不含有反應液（Reagent C）
- 可以使用50毫摩爾丙二酸鈉（Sodium malonate）作為抑制劑
- 每次更換試劑溶液時，須抽干殘留液體
- 整個操作，在避光狀態(tài)下進行
- 染色孵育時間，根據(jù)樣品和酶活性強弱調整，通常為5至10分鐘
- 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察
- 樣品染色后保存，避免光照
- 本產品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應調整處理液：
操作容器 | 建議處理液規(guī)格 | 載玻片 | 100微升 | 載玻片培養(yǎng)皿 | 1毫升 | 35mm培養(yǎng)皿 | 1毫升 | 96孔培養(yǎng)板 | 100微升 | 48孔培養(yǎng)板 | 200微升 | 24孔培養(yǎng)板 | 500微升 | 12孔培養(yǎng)板 | 1毫升 | 6孔培養(yǎng)板 | 2毫升 | 25cm2細胞培養(yǎng)瓶 | 3毫升 |
質量標準 - 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產品經(jīng)鑒定顯色清晰
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