細胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑盒 產(chǎn)品說明書
主要用途
細胞氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑是一種旨在通過捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧
化，進而與偶氮染料反應(yīng)，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，由分光光度儀比色分析未反應(yīng)棕色成分，來定量檢測細胞內(nèi)羥
自由基活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于
各種細胞（動物、人體等）裂解懸液或培養(yǎng)上清的羥自由基檢測，以及羥自由基激發(fā)劑和抗氧化清除劑
（scanvenger）等的檢測?？梢员挥糜诩毎蛲?、信號傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，
即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等
細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細胞衰老或凋亡。其中羥自由基
或氫氧基具有極度反應(yīng)性和毒性，同時半衰期短（10－9至10－10秒）。其產(chǎn)生主要是水分子受到高能量放射后
裂解、過氧化物和次氯酸反應(yīng)、過氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy
sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；
MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物偶氮亞砜（diazosulfone），通過分光光度儀
（325nm波長），檢測未反應(yīng)棕色成分，以測定羥自由基的含量。據(jù)此證明細胞內(nèi)活性氧族的存在。其反應(yīng)
系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
標記液（Reagent B） 微升
酸性液（Reagent C） 微升
染色液（Reagent D） 瓶
終止液（Reagent E） 毫升
萃取液（Reagent F） 毫升
標準液（Reagent G） 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
2
保存染色液（Reagent D）和標準液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；
酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，
注意密閉；染色液（Reagent D）避免光照；有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于標準液配制的容器
2 毫升離心管：用于樣品操作的容器
細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離
DOUNCE 勻漿器：用于細胞裂解
臺式離心機：用于樣品制備和反應(yīng)處理
石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器
分光光度儀：用于比色分析
實驗步驟
一、樣品準備
選擇一：培養(yǎng)細胞
1． 準備好25cm2 細胞培養(yǎng)瓶或60mm 細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 至5 X 106 細胞）
2． 小心抽去培養(yǎng)液
3． 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
4． 小心抽去清理液
5． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
6． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
7． 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
8． 放進4℃臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g
9． 小心抽去上清液
10．加入xx 毫升清理液（Reagent A）
11．強力渦旋震蕩15 秒
12．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
13．在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80 下）
14．將所有細胞勻漿物移入15 毫升錐形離心管
15．放進4℃臺式離心機離心5 分鐘，速度為10000g
16．小心移取3 毫升上清液到新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
17．移取10 微升進行蛋白定量檢測
18．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
選擇二：細胞培養(yǎng)液
1． 移取3 毫升細胞培養(yǎng)液到15 毫升錐形離心管
2． 放進臺式離心機離心5 分鐘，速度為10000g
3． 小心移取3 毫升上清液到新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
4． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
3
二、標準樣品配制
1． 準備好5 個1.5 毫升離心管，標記為1 至5 號管
2． 分別加入xx 微升清理液（Reagent A）到2 至5 號管
3． 移取xx 微升標準液（Reagent G）到1 號管
4． 小心移取xx 微升1 號管的標準液（Reagent G）到2 號管，混勻
5． 小心移取xx 微升2 號管稀釋的標準液（Reagent G）到3 號管，混勻
6． 小心移取xx 微升3 號管稀釋的標準液（Reagent G）到4 號管，混勻
7． 將1 至5 號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
管號清理液（Reagent A） 標準液（Reagent G） 測定體系標準MSA 濃度
1 － xx 微升xx 微摩爾/升
2 xx 微升xx 微升1 號管xx 微摩爾/升
3 xx 微升xx 微升2 號管xx 微摩爾/升
4 xx 微升xx 微升3 號管xx 微摩爾/升
5 xx 微升0 0
三、標準曲線測定
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出xx 毫升清理液
（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，標記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰
槽里備用（注意：可以使用12 次）。放在暗室里備用。然后進行下列操作
1． 移取xx 微升上述配制的標準液（Reagent G）到2 毫升離心管
2． 加入xx 微升酸性液（Reagent C）
3． 加入xx 微升染色工作液，手動混勻
4． 室溫下孵育10 分鐘，避免光照
5． 加入xx 微升終止液（Reagent E），手動混勻
6． 加入xx 毫升萃取液（Reagent F），手動混勻
7． 小心移取1 毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
8． 即刻（3 分鐘內(nèi)）放進分光光度儀（325nm 波長）檢測：獲得吸光讀數(shù)
9． 重復(fù)實驗步驟1 至8 四次
10．構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y 軸）為吸光讀數(shù)；橫座標（X 軸）為標準MSA 濃度（微摩爾/升）
四、樣品測定
1． 移取200 微升待測樣品到2 毫升離心管
2． 加入xx 微升標記液（Reagent B）
3． 渦旋震蕩5 秒
4． 室溫下孵育30 分鐘
5． 加入xx 微升酸性液（Reagent C）
6． 加入xx 微升染色工作液，手動混勻
7． 室溫下孵育10 分鐘，避免光照
8． 加入xx 微升終止液（Reagent E），手動混勻
4
9． 加入xx 毫升萃取液（Reagent F），手動混勻
10．小心移取1 毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
11．即刻（3 分鐘內(nèi)）放進分光光度儀（325nm 波長）檢測：獲得吸光讀數(shù)
12．根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)MSA 濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
13．計算樣品實際MSA 濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
14．或構(gòu)建細胞內(nèi)活性氧生成曲線：縱座標（Y 軸）為羥自由基活性氧吸光值（OD）；橫坐標（X 軸）為
組織量、蛋白量、時間點或藥物處理濃度等
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20 次操作
2． 操作時，須戴手套
3． 酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
4． 終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，注意密閉
5． 建議染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用為佳
6． 孵育時，必須避免光照
7． 建議使用新鮮樣品
8． 建議使用石英或玻璃比色皿
9． 本產(chǎn)品適合抗氧化能力檢測
10．用戶可以使用320 至360nm 之間的任一波長進行檢測
11．如果讀數(shù)大于1.5，可以使用萃取液（Reagent F）予以稀釋，但注意計算公式的稀釋倍數(shù)變化
12．本公司提供系列氧化應(yīng)急活性氧檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感 |
