細(xì)菌脂肪酶（LIPASE）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 主要用途 細(xì)菌脂肪酶（LIPASE）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團(tuán)，使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解液樣品脂肪酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。 技術(shù)背景 脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性酶蛋白分子，催化不溶性脂質(zhì)分子的酯鍵（ester bond）的水解。許多細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞外酶（exoenzyme），稱為水解酶（hydrolase），在水分子的參與下，催化底物的水解，成為細(xì)菌生理特征之一。其中脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG）、脂肪、油等，產(chǎn)生1個(gè)分子甘油（glycerol）和3個(gè)分子脂肪酸分子（fatty acid），由此用于合成細(xì)菌脂質(zhì)和其它細(xì)胞成分，以及氧化產(chǎn)生能量。食品工業(yè)中，常用于食品發(fā)酵（rancidity），例如人造奶油（margarine）等。甚至用于廚房清潔劑和替代能源的生物催化作用。同時(shí)據(jù)此用以識(shí)別革藍(lán)氏陰性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌（Bac. Subtilis）等。細(xì)菌脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產(chǎn)生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團(tuán)（－SH），與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應(yīng)系統(tǒng)為： 產(chǎn)品內(nèi)容 裂解液（Reagent A） | 毫升 | 活性液（Reagent B） | 微升 | 緩沖液（Reagent C） | 毫升 | 反應(yīng)液（Reagent D） | 毫升 | 底色液（Reagent E） | 微升 | 補(bǔ)充液（Reagent F） | 微升 | 說(shuō)明書(shū) | 1份 |
保存方式 保存 活性液（Reagent B）、 反應(yīng)液（Reagent D）和 底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器 微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備 恒溫水槽：用于孵育反應(yīng) 比色皿或酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器 分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析 實(shí)驗(yàn)步驟 一、 樣品準(zhǔn)備 1． 準(zhǔn)備好xx微升待測(cè)細(xì)菌（OD600＝0.4 至0.8，即1 至2 X 107細(xì)胞/毫升） 2． 轉(zhuǎn)移到到 1.5 毫升離心管 3． 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415） 4． 小心抽去上清液 5． 加入 xx 微升 裂解液（Reagent A），充分混勻 6． 加入 xx 微升 活性液（Reagent B） 7． 強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒 8． 置于冰槽里 15 分鐘 9． 放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 10．小心移取xx 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管 11．移取xx 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè) 12．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 二、 測(cè)定準(zhǔn)備 1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)菌裂解萃取液等），置于冰槽里 2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔10 分鐘，讀數(shù)4 次（共30 分鐘），并置零 三、背景對(duì)照測(cè)定 1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升待測(cè)樣品（100 微克細(xì)菌細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈） 3． 上下傾倒數(shù)次，混勻 4． 在 37℃溫度下孵育2 分鐘 5． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零 6． （選擇步驟）取出比色皿 7． 加入 xx 微升 底色液（Reagent E） 8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)） 9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（30 分鐘讀數(shù)－0 分鐘讀數(shù)） 四、 樣品測(cè)定 1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent D） 3． 加入xx微升待測(cè)樣品（100微克細(xì)菌裂解液蛋白）（注意：樣品須清澈） 4． 上下傾倒數(shù)次，混勻 5． 在37℃溫度下孵育2分鐘 6． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零 7． （選擇步驟）取出比色皿 8． 加入xx微升 底色液（Reagent E） 9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)） 10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 11．（選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至8，測(cè)讀新的樣品 五、計(jì)算樣品活性 單位＝微摩爾DMPTB/分鐘 六、酶標(biāo)板測(cè)定 1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品 2． 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到所有孔中 3． 加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D）到樣品孔里 4． 加入xx微升 陰性液（Reagent F）到背景對(duì)照孔里 5． 分別加入xx微升待測(cè)樣品（20微克細(xì)菌裂解液蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2） 6． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板 7． 在37℃溫度下孵育2分鐘 8． 分別加入xx微升 底色液（Reagent E）到所有孔里 9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板 10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，包括（0分鐘初始讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)） 11．活性計(jì)算 單位＝微摩爾DMPTB/分鐘 注意事項(xiàng) 1． 本產(chǎn)品為40次（酶標(biāo)板，包括20次樣品和20次背景對(duì)照）和10次（比色皿，包括5次樣品和5次背景對(duì)照）操作 2． 操作時(shí)，須戴手套 3． 每次樣品測(cè)定，需要背景測(cè)定一次 4． 樣品須澄清，至關(guān)重要 5． 樣品中避免含有TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測(cè) 6． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定 7． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗* 8． 建議待測(cè)樣本的蛋白濃度為100微克/50微升 9． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度 10．酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇 11．本公司提供系列細(xì)菌生理生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感 |
